哺乳动物细胞表达的难点和解决方案,都帮你整理好了
首先，我们需要了解什么是RNA完整性。RNA完整性通常是指RNA在提取和处理过程中保持其原始结构和完整性的程度。高完整性RNA意味着RNA在提取过程中没有发生断裂或降解，保持了其原始的序列和结构。在许多实验中，我们通常希望使用高完整性RNA，因为这样可以更准确地反映样本中的真实情况。
传送门：哺乳动物细胞表达的难点和解决方案，都帮你整理好了 其中Strep-tag 标签（包含Strep-tagII 或是Twin-Strep-tag）搭配的Strep-tag 纯化系统，纯化过程温和、目标蛋白纯度高，且相容于多种表达系统的特性，越发受到科研人员的欢迎。
图A：分别向Strep-TactinXT High Capacity 1ml 重力柱（左）和Ni-NTA 1ml 重力柱（右）中，同时加入含4mg mCherry-Twin-Strep-tag （TST） 或mCherry-His-tag （His） 萤光蛋白的ExpiCHO 细胞培养上清（注： 接下来的实验皆是取哺乳细胞表达某抗体后的上清，另加入高纯度目标蛋白进行实验）。
图片来源：哺乳动物细胞表达的难点和解决方案，都帮你整理好了）为了比较两种标签的实际纯化效果，这里做了两个小测试。分别在天然条件和变性条件下，将mCherry， GAPDH 或目的蛋白，与标签His6-tag 和Twin-Strep-tag 重组，表达后，在两种标签各自的纯化条件下进行纯化，跑胶观察结果。
哺乳动物细胞表达与纯化服务的区别是什么?
1、哺乳动物细胞表达与纯化服务的区别在于：哺乳动物细胞表达服务仅仅是将基因表达在哺乳动物细胞中，而不包括纯化步骤。哺乳动物细胞纯化服务是指将表达的蛋白质进行纯化，以获得纯洁的蛋白质。因此，哺乳动物细胞表达服务需要在细胞培养中进行蛋白质表达，而哺乳动物细胞纯化服务需要在细胞纯化中进行蛋白质纯化。
2、较低的内毒素含量：相比细菌表达系统，哺乳动物细胞产生的内毒素（endotoxin）水平较低，减少了蛋白质纯化和下游应用的辅助处理步骤。哺乳动物蛋白表达系统 哺乳动物蛋白表达系统缺点：表达成本高：相比细菌和酵母等单细胞微生物表达系统，哺乳动物表达系统的表达成本较高。
3、昆虫细胞表达系统，则以其在真核细胞环境中进行复杂翻译后修饰的能力，成为那些需要复杂糖基化和其他修饰的蛋白质的理想选择。而哺乳动物细胞表达系统，因其能够提供与人体内环境极为相似的翻译后修饰，成为表达对翻译后修饰要求严格的蛋白，如某些治疗性蛋白的首选。
4、哺乳动物细胞表达系统适用于表达含有复杂二硫键或翻译后修饰的蛋白。常用的外源蛋白表达细胞系包括海拉（Hela）细胞、人胚肾细胞（HEK293）和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）。卡梅德生物建立了完善的哺乳表达体系，包括高表达载体和细胞系，能够为客户提供更高表达水平的重组蛋白。每种表达系统在优缺点上有所不同。
几种蛋白纯化标签的比较
蛋白纯化标签比较 HIS-Tag（组氨酸标签）HIS-Tag因其无害性、小分子量、低免疫原性、与细菌兼容性及便于与其他标签结合而广受欢迎。HIS-Tag由6-10个组氨酸残基组成，通常位于目的蛋白的C端或N端。此标签纯化简便，不影响蛋白功能，且纯化条件温和。
首选标签为HIS-Tag（组氨酸标签）。由6-10个组氨酸残基组成，分子量约为0.84KD，通常插入目的蛋白的C末端或N末端。HIS-Tag在原核表达中最常用，纯化过程简便，条件温和，对蛋白影响小，且纯化后无需切除此标签，不影响蛋白功能。另一种标签为GST-Tag（谷胱甘肽巯基转移酶标签）。
GST标签（Glutathione S-transferase）（1）功能：通过亲和层析用于蛋白质的纯化。（2）优点：可以增加蛋白质的溶解度，提高表达水平，亲和材料可再生使用。生物素标签（Biotin-tag）（1）功能：生物素是一种维生素，与亲和素（avidin或streptavidin）结合极为牢固。
哺乳动物细胞蛋白表达纯化服务实验报告案例
1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板，通过密码子优化一套最适宜HEK293细胞系的基因序列。推荐客户使用钟鼎生物的自主载体pAZ-V5载体来进行实验，利用载体自带的V5信号肽序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外，为了保持蛋白的N端活性，我们在C端添加6XHis-Tag便于重组蛋白的检测和亲和纯化。
2、哺乳动物细胞表达服务仅仅是将基因表达在哺乳动物细胞中，而不包括纯化步骤。哺乳动物细胞纯化服务是指将表达的蛋白质进行纯化，以获得纯洁的蛋白质。因此，哺乳动物细胞表达服务需要在细胞培养中进行蛋白质表达，而哺乳动物细胞纯化服务需要在细胞纯化中进行蛋白质纯化。
3、蛋白表达系统是一个由宿主、外源基因、载体和辅助成分构成的体系。通过此体系，实现外源基因在宿主中的表达。蛋白表达服务内容包括哺乳动物细胞瞬时表达服务、BEV-昆虫细胞蛋白表达服务、酵母蛋白表达服务以及大肠杆菌-原核蛋白表达服务。
哺乳动物表达系统有哪些优点和缺点?
哺乳动物表达系统具有真实的蛋白质修饰、蛋白质折叠和组装能力较强等优点，但同时也存在较高的成本、时间较长和操作条件复杂等缺点。在选择表达系统时，需根据实验或应用的要求综合考虑这些因素。
哺乳动物表达系统独特优势在于其在起始信号、加工、分泌和糖基化过程中的表现，使其适合表达完整的大分子蛋白。产生的外源蛋白质在活性上远超原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近天然蛋白质。然而，哺乳动物表达系统也存在复杂构成、高技术要求、产量不大、产率低、有时导致病毒感染等问题。
大肠杆菌原核表达系优点：发展最早、应用最广泛的经典的表达系统、目标基因表达水平高、抗污染能力强。缺点：不能用于加工修饰化、很难在大肠杆菌表达体系中表达大量的可溶性蛋白。哺乳动物优点：具备了许多独特特征，因而大大提高了后代的成活率、食物及处理食物的能力的增强。
蛋白表达纯化过程梳理
采用适当的方法破碎细菌细胞，如超声波破碎或高压破碎，以释放目标蛋白质。（2）将蛋白质从细胞裂解液中提取出来，可以使用离心、过滤等技术进行初步分离。蛋白质纯化：（1）根据目标蛋白质的性质选择合适的纯化方法，如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等。
纯化方法多样，如盐析、等电点沉淀、低温有机溶剂沉淀、超滤、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等。亲和层析是利用生物分子间特异性相互作用进行分离，离子交换层析根据蛋白质所带电荷进行分离，凝胶过滤则根据分子大小进行分离。
选取诱导成功的细菌克隆，扩大诱导规模，收集菌体沉淀并保存于-20°C，准备后续分析和纯化。重组蛋白质的分离纯化 通过分析SDS-PAGE电泳结果，鉴定重组蛋白质的溶解性。这一步骤包括将诱导后收集的菌体悬浮于裂解液1中，并在-80°C下预冷10分钟。
纯化步骤包括凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析和亲和层析。亲和层析利用蛋白质与配体的特异性结合，如His标签结合Ni2+，通过特定洗脱步骤将目标蛋白从混合物中分离出来。选择合适的纯化标签是关键，如His标签便于Ni-NTA柱纯化，而器材如IPTG、超声破碎仪和层析柱等都是必备的。