传代细胞的密度（传代细胞密度要求）

请问主细胞库和工作细胞库的细胞代次不得超过多少代?还有它的冻存密度...

细胞分好几种，一般常用VERO细胞，正常工作传代代次不得超过150代，因此可以按你需要确定主代细胞及工作细胞代次，一般主代135代，工作代139代，可以更低。

生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。工作细胞库（Working Cell Bank，WCB），经主细胞库细胞传代增殖，达到一定代次水平的细胞，合并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于一定数量的安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或一130°C以下备用，即为工作细胞库。

星耀小贴士：主细胞库最多不超过两个代次，工作细胞库限定为一个代次，必须在GMP车间内完成。总结 本次科普与分享结束，回顾真核与原核细胞建库的主要差异在于构建方式，原核细胞建库通过质粒基因与感受态细胞转化至宿主细胞。RCB构建的稳定性对于后续MCB和WCB构建至关重要。

以成大生物的Vero细胞为例，他们的原始细胞库源自美国ATCC的P134代细胞，主细胞库传至136代，工作细胞库传至138代，但在生产过程中，使用的细胞不会超过140代。其Vero细胞DNA残留量已达到国家规定的标准，即每剂不超过100pg，且已有多达全球600万人次接种，未出现严重的不良反应。

验证细胞允许使用的最高代次比较困难，也要看具体是哪种细胞。药典对于生物制品的要求强调安全、有效、质量可控。比如CHO细胞，药典明确规定CHO，C28株主细胞库的传代应不超过第21代，工作细胞库应不超过第26代，生产疫苗的最终细胞代次应不超过第33代。

如何估计是否传代和传代的方式

1、细胞密度：当细胞密度达到一定程度时，需要传代以避免细胞过度生长和密度过大。细胞长到覆盖百分之八十至九十即可传代，不要等到细胞状态已经不太好才传。细胞状态：传代时机也需要考虑细胞的状态。如细胞状态良好，传代时机较为适宜。如细胞状态已经变差，那传代时机已经错过。

2、倍看密度，10倍看状态，细胞长到覆盖80-90%即可传代，不要长的过密才传，那时细胞状态已经不太好了。

3、估算步骤如下：选择合适的细胞类型和相应的培养条件，包括培养基、培养温度、CO2浓度等。在开始培养前，通过细胞计数的方法确定初始接种密度。查阅相关文献或实验室经验，确定所选细胞类型在给定生长条件下的生长倍数。

4、几代，就是几辈，举个例子，爷爷、爸爸、你、你的儿子，四辈分，就是四代。那么，如果从你爷爷开始，就是独苗，没有哥弟，这就算一代单传了。如果你爸又是独子，哪就是两代单传了。如果你也没有兄与弟，就是三代单传了。如果你还是一个儿子，四代了。

5、是 还是叫一代，一般从种子传代出来的第一代就叫一代，接着传代才叫二代，依次类推。

6、储备菌株：从标准储备菌株转接一代获得的培养物。通常为第2代或第3代菌株。工作菌株：由标准储备菌株、 储备菌株或标准物质（经证明或未经证明） 转接一代获得的菌株。通常为第3-5代菌。传代：每一次的转接培养都是一次传代的过程，可以使用液体、固体或半固体培养基。

THP-1细胞

1、进行THP-1细胞转染，即是将外源基因导入THP-1细胞的过程。这涉及到一系列步骤和技术操作，具体方法如下：转染流程简述 准备细胞：确保THP-1细胞处于良好生长状态，并对其进行适当的分化诱导。 选择转染方法：根据目的基因大小和特性选择合适的转染方法，如电穿孔法、脂质体转染等。

2、THP-1细胞的传代通常在细胞密度超过10^6/ml时进行，一般采用1：3或1：4的比例。半换液传代时，直接将细胞从原培养瓶或培养皿转移至新的培养瓶或培养皿，并补充2-3ml培养基。离心传代时，先将细胞离心，弃去上清，用新鲜培养基重悬细胞后，分配至新的培养瓶或培养皿中。

3、THP-1细胞传代时，应摇匀细胞，均分到两个瓶子里，补充等量培养基。离心后计数，按照40-50万细胞/mL的密度接种到T25瓶里，培养基量以5mL为宜。若不方便计数，按1：2比例传代。在死细胞或细胞碎片较多的情况下，建议用离心法传代，离心转速可适当降低。