细胞铺板的密度（细胞铺板密度太小了,可以用于种板吗）

siRNA转染时细胞铺板密度为什么很重要?

1、在进行siRNA转染实验时，细胞密度是一个至关重要的因素。合理的细胞密度可以显著提高转染效率，并减少实验干扰。以下是对细胞密度在siRNA转染实验中影响的详细解析及建议：细胞密度对转染效率的影响 细胞数量较少时：转染效率相对较高，因为转染试剂和siRNA更容易接触到每个细胞。

2、利用脂质体转染法时，需特别注意防止其毒性，脂质体与质粒的比例、细胞密度、转染时间长短以及培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题。转染步骤 细胞铺板：在转染前一天进行细胞铺板。根据细胞生长速度计数后进行铺板，确保第二天转染时细胞密度达到80%~90%左右。

3、**细胞铺板**：通常在转染前一天进行，根据细胞生长速度计数后铺板，确保第二天转染时细胞密度达到80%~90%左右，以提高转染效率。 **细胞转染**：以lip2000为例，转染前更换无双抗、无血清的细胞培养基。用opti-mem稀释质粒或siRNA，同时用opti-mem稀释lip2000。

4、细胞铺板：将细胞以适当的密度铺于培养板中，确保在转染时达到推荐的汇合度。加入转染复合物：将制备好的转染复合物加入到含有无双抗完全培养基的细胞中，轻轻混匀。根据培养板类型和siRNA终浓度调整各组分体积。

细胞转染的注意事项

1、细胞密度达到60%-80%时再进行转染，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。转染后收细胞时的密度不要过爆，一般为前一天下午铺板，第二天上午进行转染，48小时后收细胞进行功能检测。防止细胞污染，污染会造成转染效率低下。使用优质DNA：DNA的纯度差会显著影响转染复合物的有效形成及转染效率。

2、细胞转染的注意事项主要包括以下几点：血清处理：在DNA阳离子脂质体复合物形成时需避免血清，复合物形成后再加入。优化阳离子脂质体和DNA的比例，使用无血清或营养丰富的培养基，并根据特定细胞类型进行调整。抗生素使用：避免在转染培养基中添加抗生素，以免影响细胞活性和转染效率。

3、转染时尽量避免有双抗的存在，因为转染试剂会增加细胞膜的通透性，此时抗生素会进入细胞，增加细胞毒性，影响实验结果。及时换液：质粒转染4-8小时要进行换液，因为lip2000在细胞培养体系中存在时间过长会产生较大毒性，影响细胞状态。

细胞增殖检测——MTT法

细胞增殖检测——MTT法 MTT法，又称MTT比色法，是一种广泛应用于细胞生物学研究中的检测细胞存活和生长的方法。检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶具有一种特殊功能，即能将外源性MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐）还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜（Formazan），并沉积在细胞内。

MTT分析法是一种常用的细胞增殖检测方法，其基础在于活细胞代谢物还原剂MTT（3-（4，5）-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，噻唑蓝）的还原反应。

当需要直接反映DNA合成情况并精确检测单个细胞增殖时，选择EdU法。当需要快速检测细胞活力且细胞数量较多时，选择化学发光法。当需要追踪细胞增殖历史和增殖速度时，选择CFDA SE法并结合流式细胞仪检测。对于一般细胞增殖检测且成本有限时，MTT法也是一个不错的选择。

细胞增殖检测中的MTT法是一种基于MTT噻唑蓝物质的检测方法，用于评估活细胞数目。其主要原理和特点如下：原理：MTT噻唑蓝在活细胞线粒体中的呼吸链作用下，tetrazolium环开裂生成蓝色的formazan结晶，其生成量与活细胞数目成正比。通过测定formazan结晶的OD值，可以反映活细胞数目。

MTT法在生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等方面有广泛的应用。以下是以贴壁细胞为例的实验步骤： 细胞铺板：通常使用96孔板，收集对数期细胞，铺板密度为1000-10000/孔，每孔加液量100μl（边缘孔用无菌PBS填充）。

培养皿或者培养瓶的培养面积,铺板密度以及培养基加多少

1、孔板：底面积6cm，每孔推荐加入5ml培养液，铺板密度一般在60-80万个细胞/孔，建议至少1ml，通常2ml更为适宜。12孔板：5cm底面积，每孔2ml，密度20-30万，最少400μl，可加500或1000μl。24孔板：2cm底面积，每孔1ml，密度10-15万，500μL/孔。

2、cm皿：总面积为148cm2。T75培养皿：总面积为75cm2。T25培养皿：总面积为25cm2。铺板密度 6孔板：铺板密度一般在6080万个细胞/孔。12孔板：铺板密度在2030万个细胞/孔。24孔板：铺板密度在1015万个细胞/孔。48孔板：铺板密度在58万个细胞/孔。

3、T75培养瓶：底面积为75cm。T25培养瓶：底面积为25cm。铺板密度 6孔板：铺板密度为60-80万，或5×10^5/孔。12孔板：铺板密度为20-30万，或2×10^5/孔。24孔板：铺板密度为10-15万，或1×10^5/孔。48孔板：铺板密度为5-8万。

4、分配细胞：在2个新的培养皿中提前加入好5-6ml培养基，将离心管中的细胞悬液平均分配到这两个培养皿中。继续培养：将细胞放入37℃、5%CO2培养箱中继续培养。细胞铺板 细胞铺板是将细胞悬液均匀铺展在培养板（如96孔板）上，用于进行细胞增殖、分化、药物筛选等实验。

5、离心对细胞有一定损伤，因此除冻存外（1000rpm 3min），其他换液或加药重悬均采用800rpm 3min。半换液时，吸液动作要轻柔，避免将细胞沉淀吸走导致细胞密度过低。

6、×10^4/ cm^2的密度铺在Gelatin处理过的培养瓶上，放置在培养箱中过夜，让其贴壁。注意事项： 在执行细胞分离和丝裂霉素C处理时，应执行无菌操作。 在原代分离培养时，使用庆大霉素/两性霉素溶液可防止细胞污染。 青霉素在培养基中的使用含量应为60ug/ml以上，以避免影响细胞转染。

有谁知道MTT详细的流程和注意事项啊?谢谢了!!!

在进行贴壁细胞MTT实验时，需注意以下步骤：首先，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至每孔100ul，铺板密度为1000-10000孔/板（边缘孔用无菌PBS填充），然后在5%CO2，37℃条件下孵育至细胞单层铺满孔底。

细胞计数：在接种细胞时，确保准确计数。细胞数量直接影响实验结果，因此应使用精确的细胞计数方法进行计数。MTT溶液：MTT溶液需现配现用，避免长时间储存导致活性降低。使用新鲜的MTT溶液可以确保实验结果的准确性。避免交叉污染：在操作过程中，注意更换吸头和管尖，避免不同孔之间的交叉污染。

注意事项： 接种细胞数量：第一次操作时建议进行摸索，以确定适宜的接种细胞数量和培养时间。 细胞悬液混匀：接种时，细胞悬液必须混匀，避免细胞沉淀导致实验结果不准确。 培养条件：培养板周围一圈孔的培养液容易挥发，应尽量减小误差，确保实验结果的可靠性。

MTT试剂应避光保存。在加入MTT试剂时，如果操作迅速，则不必过于担心光照的影响。若需要进行长时间的操作，务必在避光条件下进行，以免光照对试剂产生影响。通过上述步骤和注意事项，可以准确地进行MTT实验以检测细胞活性。该实验在评估细胞活性和增殖能力、药物筛选和药物毒性评价等方面具有广泛应用价值。