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简述cDNA第一链与第二条链的合成方法

1、合成的cDNA第―链在4%的碱性琼脂糖凝胶上电泳,用末端标记的pBR322限制性片段为分子量标准,电泳后,铺X-光片,进行放射自显影,确定cDNA第一链的大小。2:第二链的合成 a:第一链合成完毕后,直接进行第二链的合成。

2、cDNA第二链合成: 可通过两种方法,一种是利用cDNA第一链的发夹环作为引物,另一种是RNase H修饰法保留mRNA5端的顺序。 cDNA甲基化: 是对合成的cDNA进行必要的修饰,可能影响其功能和稳定性。 接头连接: cDNA与载体DNA的连接,使用末端转移酶、Klenow片段或粘性末端连接技术完成。

3、完成第一链合成后,取部分产物冷藏,其余合并进行第二链合成。加入DNA Polymerase I buffer、dNTP、ddH2O、RNase H、DNA Polymerase I等试剂,16℃反应5小时,70℃灭活,得到200ul cDNA第二链反应体系。

ds-2cd4012f能否二次开发

ds-2cd4012f不能二次开发。也可以选择试剂盒方法,如Promega的Universal RiboClone cDNA Synthesis System,里面就包含从RNA反转录成cDNA第一链,以及合成cDNA第二链所需的试剂。

分子杂交的分子杂交方式

分子杂交技术是一种利用核酸之间的互补配对,在固相支持物上固定核酸,通过放射性探针检测特定序列的实验方法。常见的杂交技术包括Southern、Northern、斑点、狭槽和菌落杂交。Southern杂交针对DNA片段,涉及酶切、电泳转移、预杂交、杂交和显影过程,信号强度受DNA比例和探针活性影响。

【答案】:以发明者命名的3种分子杂交技术为:(1)Soutliern Blotting:特指DNA印迹杂交;(2)Northern Blotting:特指RNA印迹杂交;(3)Western blotting:特值蛋白质印迹杂交。

分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象,分子杂交基本可分为以下几大类:(1) Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。

分子杂交技术在生物化学和分子生物学中广泛应用,其中固相杂交法是常见的一种方法。首先,将单链核酸(如双链需先变性)吸附到硝酸纤维素膜上,接着通过溶液中的标记探针进行杂交。结合电泳和放射自显影,可形成杂交图谱,用于定性或定量分析。

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