细胞提取RNA求助
1、一般都用biog提取法 请自行准备：无水乙醇、PBS及无RNA酶的5mL离心管。 取出析出液和洗涤液，按以下操作：a） 析出液：5mL加入25mL无水乙醇；9mL加入51mL无水乙醇。b） 洗涤液：9mL加入21mL无水乙醇；18mL加入42mL无水乙醇。
2、e. 血液处理：取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10000rpm离心1分钟。弃上清，若沉淀含有红细胞，可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1 ml裂解液混匀。将处理后的样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3、Carrier RNA是共沉淀剂，就是和你提取的RNA或者DNA同时沉淀，增加沉淀的量和体积，使你最后的沉淀可视。
4、在200微升黄枪头尖部切割0.5厘米后进行操作。加入1/5体积的氯仿（约200微升），上下颠倒2至3分钟。然后在4℃下以16000g离心15分钟，轻轻移取上清至新的Eppendorf管中（约700微升），避免扰动中间层或使Eppendorf管变温。
5、贴壁细胞的话去培养液，PBS洗一遍，加Trizol吹打下来。组织的话，在液氮里面捣碎，然后粉末放进Trizol，用超声粉碎器粉碎（超声每3秒，停10秒冷却，直到看不见组织碎末）。
细菌感染细胞模型构建的实验流程
1、确定实验条件，包括MOI（细菌量/细胞量）、攻菌时间及实验容器选择，如6孔板。实验流程如下：提前一天进行细胞铺板，选择合适时间段（3h、6h、12h）攻菌，设置不同MOI（0.10）。每个时间段使用两个6孔板，每孔接种约2*106个细胞，加2ml完全培养基。
2、免疫细胞化学实验步骤分为以下几个阶段： 细胞破膜：使用组化笔在盖玻片上标记细胞分布均匀的位置，滴加破膜工作液，室温下进行20分钟的孵育，后用PBS进行三次清洗。 血清封闭：在组化圈内滴加3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30分钟。通常选择与二抗同一来源的血清进行封闭，以防非特异性结合。
3、构建稳定细胞系的方法包括选择表达系统、选取合适的载体、实施转染或转导、筛选和挑选成功转入的细胞、克隆与增殖筛选出的细胞等步骤。整个过程涉及非病毒与病毒介导的递送策略、CRISPR/Cas9基因编辑技术、高通量筛选和自动化、数据和流程管理软件以及分析技术的应用。
4、该流程集合涵盖了从入门到高级的不同研究水平的实验技术，包括细胞培养、动物模型构建、实验方法的全流程详解，以及WB和IHC实验的具体操作。每一步都经过前辈们无数次的验证，确保其可靠性和适用性。具体来说，该集合包括：不同研究水平实验技术流程，为不同阶段的科研人员提供个性化解决方案。
5、注射后7天，空腹血糖水平≥250mg/dL的小鼠被定义为糖尿病状态。注意事项 柠檬酸钠缓冲液需现配现用，确保pH值在2-5范围内，过滤去除杂质，灭菌视条件而定。使用前再次检测pH值。以上流程涵盖了从动物准备到2型糖尿病模型构建的关键步骤，希望对初学者有所帮助，确保实验顺利进行。
6、接下来，选择合适的实验材料，包括细胞系和动物模型。对于AP-2转录因子的研究，可以选取免疫细胞作为实验材料；而对于MYC转录因子，可以考虑使用癌细胞系或动物模型。实验材料的选择将直接影响研究结果的可靠性和生物学意义。然后，通过构建基因敲除或过表达载体，实现对这两种转录因子的调控。
手把手教学——TRIzol提取细胞RNA的经验分享
需注意TRIZOL有毒，操作时需在通风橱内进行，并做好个人防护。实验步骤 以细胞6孔板为例，通常每孔种入100万细胞，对于TRIZOL法而言已足够，但对于新手，提取的RNA浓度可能较低，因此，建议在6孔板内铺入200万或300万细胞。
首先，准备细胞，例如在6孔板中，每孔通常种100万至200万细胞，以保证提取的RNA足够用于后续实验。对于新手，可能需要做浓度或时间梯度实验。实验中需注意使用TRIZOL时在通风橱内进行，遵循无酶操作，避免RNase污染。在实验步骤中，先用PBS清洗细胞，然后加入RNA裂解液裂解并转移到EP管中。
Trizol法 Trizol法是快速从细胞和组织中提取RNA的一种方法，主要成分包括异硫氰酸胍（GITC）和苯酚。GITC能够使蛋白质和RNase变性，保护RNA的完整性。裂解细胞后，加入氯仿进行离心，RNA将存在于水相中，而DNA和蛋白质则存在于有机相，实现分离。
准备实验材料和试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC处理的水、RNAase抑制剂、移液器、EP管、RNA Marker、琼脂糖凝胶、电泳仪等。 细胞破碎：将2-3×10^6个细胞加入1mL Trizol试剂，充分裂解细胞，保证细胞完全破碎。
方法一：TRIzol法基础步骤：使用异硫氰酸胍和苯酚裂解样本，分离后RNA位于水相上层，DNA在中间，蛋白质在下层。操作实例：以果蝇成虫为例，先研磨样本至粉末，加入TRIzol裂解，离心去除不溶物质，再进行氯仿处理分离RNA。
RNA提取方法?
RNA提取方法有以下几种： 离心柱法提取RNA 离心柱法是一种常用的RNA提取方法，其原理是利用吸附柱或离心柱上的吸附材料对RNA进行选择性吸附和分离。具体操作流程包括样品处理、裂解、吸附、洗涤和洗脱等步骤。这种方法具有操作简便、快速和效率高的特点。
提取RNA的方法主要有以下几种： 机械破碎法。此方法通过机械破碎细胞结构来提取RNA。包括研磨、匀浆等步骤，可使细胞壁破裂，释放出RNA。 化学试剂提取法。这是一种常用的RNA提取方法。
提取RNA的方法有以下几种： 匀浆处理法提取RNA 这种方法主要用于从细胞中提取RNA。它主要包括两个步骤：首先，使用高速组织捣碎机或匀浆器将细胞破碎，释放出其中的RNA。其次，通过离心等方法去除不溶性的细胞碎片和杂质，得到RNA溶液。这种方法简单易行，适用于大量样本的处理。
酚氯仿法是一种经典的RNA提取方法。该方法利用酚和氯仿的萃取原理，通过反复抽提将RNA从细胞或组织中提取出来。这种方法可以有效去除蛋白质等杂质，得到相对纯净的RNA。但操作相对复杂，需要一定的实验技巧。 酶消化法 酶消化法主要是利用蛋白酶K等酶来消化细胞或组织中的蛋白质，从而得到RNA。
酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb 甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。
rtpcr需要多少个细胞的rna
朋友你好！如果用293T细胞那么12孔板一个孔的细胞量就够，但293T属于细胞个体小且长得比较密比较多的那种，如果换做HeLa或者更大更稀的其他细胞，那还是6孔板或者35mm小皿更保险。
在进行rtpcr时，对于rna的浓度和纯度要求，通常浓度在20ng/ul以上即可满足实验需求。如果样本来源于组织，其浓度可能会非常高，达到几百甚至几千。然而，对于病毒或少量细胞，所需的浓度会相对较低。为了确保rna的纯度，必须使用仪器进行测量。
rtpcr时提取rna的浓度和纯度要求：浓度20ng/ul以上足够了，如果用的是组织提取，浓度一般很高，可以达到几百甚至几千。如果你用的是病毒、少量细胞，浓度低一些也没有关系。纯度需要用仪器测一下。260/280理论值应该有0以上，260/230值2以上基本合格。
rtpcr操作有5个步骤。具体操作如下：总RNA提取。DEPC处理水溶解RNA，-20℃保存，备反转录之用。反转录。
提RNA浓度为什么这么低
1、原因如下：提取过程中RNA降解。试剂盒质量不佳或使用不当，导致纯度下降。操作技巧不妥，例如细胞破碎不彻底。
2、提取rna测浓度时只有几十的原因可能是降解。人体一个细胞含RNA约10pg（含DNA约7pg）。与DNA相比，RNA种类繁多，分子量较小，含量变化大。RNA可根据结构和功能的不同分为信使RNA和非编码RNA。非编码RNA分为非编码大RNA和非编码小RNA。非编码大RNA包括核糖体RNA、长链非编码RNA。
3、提取rna测浓度时a260/a280大于3的原因可能是降解。一般对于dna，纯净的时候比值是8，而对于rna则是接近0。如果超过这个值，那么最有可能的就是核酸降解了，因为寡聚的核酸和核苷酸在260的吸收峰比长链核苷酸要大，所以会使比值上升。
4、比如霍乱用trizol法提取效果极差，太低就说明降解严重~~~ 其实提取RNA的条件没那么苛刻，最后确定也是qiagen 的kit提取。 另外，然后浓缩。 2，为什么要测RNA浓度 1，而沙门菌提取效果就较好，用于消除表面RNase的污染。RIN（RNA Integrity Number），那么最有可能的就是核酸降解了。
5、白色沉淀只是蛋白等杂质，RNA在里面只占很少一部分。所以，不能用沉淀的多少判断的RNA多少。
6、总结起来，还没有我们这个RNA提取技术第一的公司搞不定的， 有3种解决方法：尝试强力裂解液CLB，并且加大处理量，比如加大10倍处理量，然后用几个基因组先清除后，把所有的上清加到一个吸附柱上去，就能提高浓度。例子：比如北京药用植物研究所，植物的根，块根产量很低。