质粒大提的密度（质粒大提试剂盒说明书）

质粒及siRNA转染细胞操作技巧-实验干货

1、避免双抗存在，转染试剂增加细胞膜通透性，此时抗生素会进入细胞，增加细胞毒性。 质粒转染4-8小时后进行换液，防止lip2000在培养体系中产生较大毒性。 转染试剂与质粒或siRNA混合后需静置，以确保转染复合物的形成。 转染试剂的加入量需通过预实验确定，以获得最佳转染效果。

2、操作流程详解 转染过程的核心步骤可以总结为：首先，将125微升的Opti-MEM与5微升的Lipo3000混合，形成转染复合物。接着，为DNA准备一个步骤，将125微升的Opti-MEM加入1-5微克的DNA，再加入2-5微升的P3000（是DNA量的两倍），确保DNA与转染剂充分结合。

3、细胞转染过程包括准备转染试剂、选择合适的混合比例、在室温下混合、清洗培养板、加入混合液、培养细胞一小时、移除混合液或加入完全培养基继续培养。第二次细胞传代包括观察转染结果、记录绿色荧光蛋白表达情况、重新转入培养皿、在正常条件下培养、按照染色要求固定细胞。

4、注意转染前细胞状态、质粒处理以及转染后筛选的最佳时间窗口。DNA与转染试剂的比例调控，需要根据细胞特性进行个性化调整。实战指南：选择转染策略时，需根据实验需求和预期效果，灵活选用适宜的试剂，以提高转染效率和成功率。

5、在实验操作中，转染是一种常用技术，目标是将特定性质的质粒导入细胞，通过转染试剂如PEI或Lipofectamine RNAiMAX实现。Lipofectamine RNAiMAX主要针对siRNA和Stealth RNAi 双链体的高效、低毒转染，分为正向和反向两种方式，这里着重介绍反向siRNA转染步骤。

6、实验室长期使用日常型质粒抽提试剂盒进行质粒抽提，转染细胞效果良好。我认为，影响SiRNA质粒转染效率的因素主要有两点：首先，需特别注意大肠杆菌（Escherichia coli）的污染问题，在收集菌体沉淀时应避免菌液散落，定期使用75%乙醇擦拭手套，以减少污染。

大肠杆菌感受态细胞制备时的CaCl2浓度到底是多少

制备感受态细胞所用的CaCl2等试剂需为最高纯度，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。此外，细胞的生长状态和密度也至关重要。推荐从-70℃或-20℃甘油保存的菌种直接转接用于制备感受态细胞的菌液，避免多次转接和低温保存的培养菌液。

大肠杆菌感受态细胞的制备 （ CaCl2 法）将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟。 弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，4℃下3000g离心10分钟。

大肠杆菌感受态细胞制备时的 CaCl2 浓度到底是多少（1）质粒DNA的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。

加入4 ml预冷含15%甘油的0.1 mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；（7）感受态细胞100 μL分装，贮存于-70 ℃保存备用。

感受态细胞的制备 （cacl2 法）将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟。弃去上清，用预冷的0.05mol/l的cacl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟后，4℃下3000g离心10分钟。

dna琼脂糖胶电泳实验中,为什么会出现三条带?这三条带表示的kb为什么不一...

综上所述，DNA琼脂糖胶电泳实验中出现的三条带分别代表超螺旋、线性和开环质粒DNA，其kb值的差异反映了它们不同的结构和大小，这是电泳技术中一个常见的现象。

然而，有时会发现三条带的情况，这并不罕见。这主要是由于质粒DNA的三种不同形态导致的：超螺旋、环形以及线性。超螺旋DNA结构稳定，电泳速度较慢；环形DNA在一定程度的降解后转变为线性，其电泳速度则会加快。因此，这三种形态在凝胶中移动的速度不同，形成了三条可见的带。

首先，引物二聚体在PCR扩增过程中可能会形成，这种情况下会在电泳图谱上显示出一条带。其次，PCR产物中双螺旋结构与链状DNA形态的差异会导致它们在琼脂糖凝胶上的迁移率不同，从而在电泳图中形成两个带。再者，如果原始模板DNA与PCR产物之间存在较大的差异，也可能导致电泳图谱上出现额外的带。

说明你提出的DNA不纯，存在三种DNA的空间状态。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。

为什么提取质粒时加入异丙醇出现了白色絮状沉淀?

在质粒提取过程中，加入异丙醇后出现白色絮状沉淀的现象，主要是由于异丙醇的特性与质粒DNA相互作用的结果。异丙醇能溶解许多有机物，包括质粒，但其对蛋白质具有沉淀作用。当处理细菌时，细胞壁和细胞膜破裂，释放出DNA，包括较大的染色体DNA和较小的质粒DNA。

异丙醇与蛋白质反应，使其沉淀。采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。

蛋白质。根据查询天天文库官网显示，提取质粒时加入异丙醇会出现白色絮状沉淀，其成分是蛋白质。

调整离心时间，过长过短均影响效果。 纳诺滴检测结果：A260为核酸，A280为蛋白质，A230为杂质，比值判断纯度。最后，快速提取优质质粒是关键。特别说明：对于大质粒，手工提取优于试剂盒，主要差异在于第六步后，不转移上清至吸附柱，而是加入异丙醇沉淀，高速离心后清洗，溶解不完全的即为蛋白。

接下来，静置5分钟后加入NEU，调节pH至中性，使细胞碎片、变性蛋白质和染色体DNA沉淀。在高盐条件下，质粒DNA在溶液中游离。离心后，蛋白质和基因组DNA沉淀，质粒DNA存在于上清液中。使用EQU处理滤柱，分别加入10ml和5ml，直至无蓝色出现，形成蛋花状或絮状沉淀。