细胞转染之稳定细胞株的构建
1、构建稳定细胞株通常涉及将外源DNA克隆到具有抗性或选择基因的载体，载体转染到宿主细胞并整合到染色体中，筛选出稳定表达目的蛋白的细胞株。服务内容包括基因过表达、突变、沉默等科研用稳转细胞株构建，以及重组抗体、细胞因子等生物药的稳转细胞系前期筛选。
2、构建稳定细胞株有两种主要方式，一种是使用病毒载体介导的基因递送，另一种是利用质粒转染。使用病毒介导的基因递送通常会导致细胞的死亡或转化，因此它不适用于需要形成稳定表达的蛋白质的应用。因此，本文将重点介绍利用质粒转染构建细胞稳转株的方法。
3、稳转细胞株构建 选择宿主细胞系：选择能够稳定承载外源基因的细胞系作为宿主细胞。常用的细胞系包括HEK29CHO、HeLa等。构建表达载体：设计和构建包含目标基因的表达载体。在载体中通常包括启动子、选择标记基因（例如抗生素抗性基因）以及目标基因的编码序列。转染：将表达载体转染到宿主细胞中。
4、稳定转染细胞株的构建通常在转染后的几周到几个月内进行筛选。在进行稳定转染后，细胞需要一定的时间来集成外源基因并表达出相应的蛋白。在此期间，通常会使用筛选标记物（例如抗生素或荧光标记）来筛选出成功转染并集成外源基因的细胞株。
5、使用构建好的载体或包装好的病毒对目标细胞进行转染，将外源基因导入细胞。转染后，通过添加特定抗生素进行筛选，以获得带有抗性标志的细胞，这些细胞通常能稳定表达目标基因。最后，筛选出的细胞进行鉴定，确认其是否已成功整合并稳定表达目标基因，从而得到所需的稳定细胞株。
【实验技巧篇】细胞转染技术最详解的经验及操作技巧
物理介导的细胞转染技术包括显微注射技术、基因枪技术和电穿孔技术。显微注射技术适用于任何类型的细胞，但技术要求高，针头注射会对细胞造成损伤。基因枪技术操作简单，DNA用量少，但需要特殊的设备和金颗粒或钨颗粒价格昂贵。电穿孔技术操作简单，毒性低，转染效率高，适用于大规模细胞转染。
细胞状态和DNA质量是关键。优化转染条件，如使用Entranster试剂，同时避免使用抑制剂。细胞应处于健康状态，密度在70%以上，且DNA纯度需在8-0之间。RNA转染时，纯化和防止RNA酶污染是关键，同时选择适合的转染试剂。siRNA转染时，纯度、浓度控制和标记siRNA的使用有助于优化实验结果。
首先，转染前，贴壁生长的细胞需要通过胰酶处理成单细胞悬液，细胞密度应控制在70-90%或2×106-4×106细胞/ml，且最好在转染前4小时更换新鲜培养液。质粒DNA需要纯净，OD260/280比值大于8。在实验过程中，培养基中的血清和抗生素都可能影响转染效果。
**细胞铺板**：通常在转染前一天进行，根据细胞生长速度计数后铺板，确保第二天转染时细胞密度达到80%~90%左右，以提高转染效率。 **细胞转染**：以lip2000为例，转染前更换无双抗、无血清的细胞培养基。用opti-mem稀释质粒或siRNA，同时用opti-mem稀释lip2000。
实验小白如何有效提高细胞转染率?
1、**转染操作**：在转染过程中，需优化实验条件，如核酸量、孵育时间等。使用无血清配置的复合物可以提高转染效率，避免血清中蛋白质的干扰。同时，抗生素的影响也需要考虑，以避免降低细胞活性。 **细胞培养和效果检测**：优良的培养试剂是关键。血清的质量变化直接影响细胞生长和转染效率。
2、答案是可以的，但对于一些难转染的细胞，建议在转染初期使用无血清培养基，至少一小时后再换至含血清培养基。在转染过程中，如何确保DNA与转染试剂的适宜比例？通常推荐使用DNA与PolyFast Transfection Reagent的用量比例为1：3，但根据不同的细胞类型和培养条件，最佳比例可能有所变化。